一、项目简介
本项目利用角蛋白酶生产菌株降解羽毛蛋白，生产多肽和氨基酸，其工艺简便、处理方式温和、产品性能优异。结合项目单位在行业中的影响力（全国第二）及已有的客户群和国内外销售渠道，本项目的实施有利于革新生产模式，引领行业升级，扩大市场占有率，同时实现废弃物资源化与环境治理、使农业增效、农民增收。本项目将发酵工程技术与装备应用于羽毛多肽和氨基酸生产中，对促进禽类产业的发展具有引领和示范作用，也为自动化控制在该行业的应用、实现工业4.0奠定了坚实的基础。
二、主要技术路线和实施方案及开发过程总结
（1）技术路线：
①基于提升角蛋白酶活性与底物特异性的生产菌株分子改造与酶的改性
目前角蛋白酶的生产应用尚存在底物专一性较差、水解底物效率不高等问题，在一定程度上阻碍了角蛋白酶的应用潜力，且酶活水平尚有进一步提升空间。本项目通过角蛋白酶结构预测与解析，运用定点突变、定向进化等手段，以及角蛋白酶基因簇组装技术，获得高活性、高底物特异性的角蛋白酶工程菌株。预期角蛋白酶酶活达到 4500 U/mL，提取总收率65%以上。
②基于生产菌株代谢特性的发酵条件优化与羽毛降解能力控制
结合角蛋白酶生产菌株菌体生长与产酶生理特性，通过培养条件的多变量优化控制技术及分阶段培养控制技术，优化生产菌株的羽毛降解能力，进一步缩短生产周期，提高生产强度，逐步优化产品放大生产工艺。
③基于水解效率及产物成分分析的羽毛水解生产多肽和氨基酸性能评价与方案优化
通过改造菌株和角蛋白酶分子来实现对羽毛等角蛋白废弃物的高效水解，实现饲料多肽与目标氨基酸的高效生产。根据水解效率与水解产物成分分析，通过酶解工艺控制，开展角蛋白酶生产菌株的应用性能评价，优化水解产物中多肽与目标氨基酸的产物配比，提升底物转化率至5%以上。
④高纯度多肽和氨基酸产物高效分离系统及闭路循环清洁生产体系的构建
应用陶瓷膜、纳滤膜与结晶/工业色谱分离相结合的方法实现多肽和目标氨基酸的高效分离。水解液以批次方式进入闭路循环，经陶瓷膜过滤除菌、纳滤膜截留多肽、活性炭吸附脱色、浓缩液等电结晶离心/工业色谱分离获得目标氨基酸，剩余的少量废液处理后可获得有机无机混合肥料。闭路循环清洁生产体系构建如下：
（2）实施方案及开发过程：
①项目产品可以替代鱼粉应用于饲料行业。本项目的角质蛋白酶解生产多肽和氨基酸的中试技术已经成熟，目前已有新沂市佳威饲料有限公司、宁波隆鑫生物科技有限公司等客户订货；项目产品一旦规模化生产，即可迅速扩大市场。
②国内市场对多肽和氨基酸需求量大，应用范围广。以国内市场销售为主，在细分市场的基础上，确定重点区域，寻求其突破口。确定以长三角、珠三角、东北三省、青海、西藏、新疆地区为主，以替代饲料鱼粉等领域为突破口，有序推进，定位几家知名企业用户，形成示范效应，以点带面，发展一片成熟一片，逐步推向全国市场。
③针对国际市场，目前对多肽和氨基酸需求量较大的国家和地区主要有美国、泰国、越南、日本、印度、俄罗斯、荷兰、德国、印度尼西亚和韩国等，公司将突出产品的技术优势，质量优势，成本优势，通过国际展览，洽谈会议、电子商务、国外代理等方式，拓展国际市场，稳步增加出口量。
④坚持“诚信守诺”的营销宗旨，整体提升销售人员的素质和业务技能，加强产品宣传、广告推介、信息发布，创新销售理念，主动为客户筹划，抢占市场空间。以江南大学为技术依托，对现有客户与潜在用户进行技术指导，提供一条龙增值技术服务，扩大竞争优势。
三、本技术（产品）与同类领先水平技术（产品）的对比分析报告
1、本领域技术（产品）国内外现状
（1）角蛋白酶的开发及应用
在产角蛋白酶菌株的选育工作中，美国学者Lin等筛选获得的Bacilus licheniformis PWD-1是研究最早的产角蛋白酶菌株。此后印度人Gupta和我国学者曹张军等先后从B.licheniformisER-15 、S.maltophiliaDHHJ等菌株中分离获得一系列角蛋白酶。堵国城团队筛选得到的角蛋白酶生产菌株Bacillus licheniformis BBE11-1e和Stenotrophomonas maltophiliaBBE11-1所产角蛋白酶对羽毛、羊毛角蛋白均有高效降解能力。
目前国内外对角蛋白酶的分子改造鲜见报道。堵国城团队通过角蛋白酶KerSMD的C端架构改造、N/C端结构互换、底物结合口袋特殊氨基酸突变等策略，筛选到摧化效率高、底物专一性强、耐热的角蛋白酶突变株。
对角蛋白酶的发酵过程优化研究主要由我国学者Wang、蔡成刚等通过培养基优化，分别将重组枯草芽孢杆菌的角蛋白酶产量提高至304和124.8U/ML。堵国城团队通过分阶段温度控制、底物流加等发酵过程优化控制策略，将该酶活性稳定在3000U/ml以上，为目前报道的最高水平。
虽然国内外学者军队角蛋白酶进行了较多的研究，但具有代表性的商品角蛋白酶仍掌握在BRI、Protes Biotech、Genentech等几家国外公司手中，用于动物饲料和医疗领域。
（2）羽毛生产多肽和氨基酸
经粉碎法加工的羽毛粉中可被畜禽利用的蛋白不足10%，而其水解液因含有大量的多肽和氨基酸，基本能被动物吸收利用。采用加压法或酸碱法制备羽毛多肽和氨基酸因其工艺条件的限制，仅能以鸭毛、鹅毛为原料，产品存在设备要求高，生产过程能耗大，转化率低，处理成本高、产物单一及稳定性差等缺点。
本项目以角蛋白酶生产菌株对羽毛的高效降解能力为基础，利用多种禽类羽毛生产多肽和氨基酸，无需复杂的前处理，生产过程温和，不仅保持了多肽的活性和氨基酸的丰富性，同时酶解反应温和，无污染，这将是行业发展的必然趋势。
2、目标产品处于产业链重要环节的阐述
目标产品以羽毛为原料，可解决禽类产业链上游加工时废弃物的资源化利用及环节污染问题。生成的多肽和氨基酸可替代鱼粉、豆粕等，以此生成的蛋白饲料成本低、添加量少、吸收转化率高。同时多肽中含有抗菌肽，可减少抗生素使用，促进生态养殖，提高肉品质量。此外，提取产品后的废液可用作土壤改良剂，使农业增效。
3、可实现的重大技术突破及对产业结构调整和整体水平提升作用
羽毛是禽类加工时产生的副产物，我国每年产品近120万吨。仅江、浙、皖三省的羽毛集散地每天吞吐量2000吨左右。禽类养殖亦是苏北市县特色产业，新沂市每年家禽宰杀量2500万羽左右，产生羽毛约5000吨，羽毛中除鸭毛、鹅毛制取少量羽绒外，其余作为废弃物，造成资源浪费和环境污染。
羽毛中蛋白含量高达85%-90%，其水解产物与豆粕、鱼粉等畜禽日粮媲美，且原料来源广、利用率高、产品价格低。目前用羽毛制备多肽和氨基酸的方法主要为高温高压和酸碱法，但存在生产过程能耗大、处理成本高、产物单一及稳定性差等缺点。同时水解法仅局限于处理鸭毛、鹅毛，而对羽毛中占主导地位的鸡毛尚无适用的工艺，已成为拓展羽毛资源利用的瓶颈。
本项目利用角蛋白酶生产菌降解羽毛蛋白，生产多肽和氨基酸，其工艺简便、处理方式温和、产品性能优异。结合项目单位在行业中的影响力（全国第二）及已有的客户群和国内外销售渠道，本项目的实施有利于革新生产模式，引领行业升级，扩大市场占有率，同时实现废弃物资源化与环境治理、使农业增效、农民增收。本项目将发酵工程技术与装备应用于羽毛多肽和氨基酸生产中，对促进禽类产业的发展具有引领和示范作用，也为自动化控制在该行业的应用，实现工业4.0奠基了坚实的基础。
四、技术需求
（1）基于计算流体力学模拟的角蛋白酶发酵过程放大技术
通过流场分布与流体力学计算，研究大罐中角蛋白酶发酵体系的动量传递、热量传递和质量传递的特点，优化发酵罐结构与操作参数，强化动量传递、热量传递和质量传递，降低流场变化和不均一性对角蛋白酶大罐发酵过程的影响。在此基础上，确定菌体生长、角蛋白酶表达的关键时间节点，进而综合优化，在大罐水平上对角蛋白酶合成、成熟及稳定化进行精确调控，在大罐中高效生产角蛋白酶。
（2）基于发酵动力学特征的角蛋白酶发酵过程智能控制技术
针对角蛋白酶发酵过程的特点，综合利用过程参数、数据采集与处理技术、过程控制模型优化与控制执行、信息流处理、分析、通讯与管理技术，获取的微生物本征动力学与宏观动力学过程参数。利用数据挖掘的方法提取上述参数的内在联系，修正现有过程数学模型，并设计或集成相关软件。基于以上数学模型，对可能影响反应的控制系统故障进行在线诊断和早期预警，保证发酵反应在设定的理想环境水平下进行。
（3）基于酶解羽毛的多肽和氨基酸工业规模高效生产
针对酶解羽毛过程中实时产物分析结果，根据多肽分子量分布范围和时间以及目标氨基酸产量变化规律制定相应的生产策略，达到多肽和氨基酸产品产量的最大化。针对工业化大规模生产中可能出现的问题，为了保证产品质量和生产效率，需要进一步研发传感器技术对酶解过程中底物、中间产物和目标产物的信息变化进行实时的监测，建立酶解生产过程的自动取样，样品自动稀释和自动分析测定系统，实现多肽和氨基酸的高效生产。
（4）基于高效膜分离与清洁生产的多肽和氨基酸分离提取技术
将公司已建立的多肽和氨基酸中试提取工艺放大至工业规模，重点进行两方面研究：1) 优化超滤工序的操作参数和抗污染膜组件，提高分离膜的选择性、通量、抗污染能力及使用寿命，开发高效膜污染控制技术；2) 充分利用酶法水解羽毛生产多肽和氨基酸过程中可能产生的废弃物，让整个生产过程零污染、零排放。
