本发明公开了一种快速构建配对sgRNA的Cas9双元表达载体文库的方法,涉及基因工程领域中快速构建双元载体的方法。本方法在构建CRISPR‑Cas9双元表达载体基础上,根据特定的基因设计靶标序列设计对应的正反引物,引物具有两个BsaI酶切位点;通过一步PCR得到靶标序列和两个BsaI位点的目的片段,然后通过简单酶切和连接的方式将上述片段构建进入带有Cas9基因的双元表达载体中,形成配对的sgRNA的Cas9载体。本发明能够高效建立随机文库和非随机文库,可以用于植物中基因功能的大规模筛选,同时可以用于多基因间基因互做网络的构建和研究;实验结果证明本方法成功高效地构建了14个靶点(来自14个基因)的随机配对sgRNA的Cas9双元表达载体文库。
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