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本发明提供同时检测肠出血性大肠杆菌O45和O145的纳米PCR试剂盒及其应用,涉及出血性大肠杆菌的检测技术领域。该试剂盒,包括第一引物对和第二引物对,所述第一引物对包括序列如SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示的引物;所述第二引物对包括序列如SEQ ID No:7和SEQ ID No:8所示的引物。本发明还提供所述纳米PCR试剂盒在以非诊断为目的检测肠出血性大肠杆菌O45和O145中的应用。本发明纳米PCR试剂盒,能够快速、特异的同时检测样品中两种血清型的EHEC,具有很好的应用前景。